细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒(柱式吸附)

商品介绍：

本试剂盒是目前先进的DNA Ladder抽提试剂盒之一。本试剂盒是针对细胞凋亡过程中产生的核小体间DNA链断裂而设计的。可以非常有效地抽提小片段为180-200bp的DNA ladder，同时又可以抽提到大50kb左右的基因组DNA。本试剂盒可以抽提50个样品。

DNA ladder也称DNA fragmentation，是细胞凋亡的一个重要指标。通常观察到DNA ladder，就可以判定细胞发生了凋亡。

样品首先被蛋白酶K消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过两次洗涤去除各种杂质，后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。

通过DNA纯化柱方式抽提DNA ladder比用传统的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易损失。试剂盒提供了RNase A，可以获得不含RNA的高纯度总DNA，排除了RNA对DNA ladder观察造成的干扰。

本试剂盒每次多可以抽提20mg组织或200-350万个培养细胞。样品用量过多，反而会影响抽提效果。纯化柱对于DNA的大容量约为30微克。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15-25微克总DNA，每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10-30微克总DNA，每25毫克心、肺组织可以抽提得到5-10微克总DNA，每10mg脾组织可以抽提得到5-30微克总DNA。样品的用量请勿超过纯化柱的容量，样品用量好能保持在纯化柱容量的70%或以下。当然过少的样品也不利于检测到DNA ladder。

对于培养细胞的凋亡检测，通常6孔板一个孔的细胞就足够用于DNA ladder的抽提和检测。

试剂盒组份：

样品裂解液A——————10ml

样品裂解液B——————11ml

洗涤液I——————21ml(第一次使用前加入7ml无水乙醇)

洗涤液II——————16ml (第一次使用前加入24ml无水乙醇)

洗脱液——————22ml

蛋白酶K——————1.1ml

RNase A——————220μl

DNA纯化柱及废液收集管——————50套

储存条件：室温，有效期一年。( 蛋白酶K需-20℃保存)
公司产品仅供科研使用，下列是产品属性：

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作程序：

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

13.滴加化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染，充分水洗。

16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

注意事项：

①加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

④底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

⑤洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

⑥使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

⑧试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

粘蛋白/粘液1(MUC1)英文名称：MUC1 ELISA Kit血管生成相关蛋白6抗体包装1g

再生基因蛋白1a(REG-1a)英文名称：REG-1a ELISA KitMuellerian缪勒管激抑制因子抗体包装5g

载脂蛋白H(Apo-H)英文名称：Apo-H ELISA Kit酪蛋白激受体A8抗体包装1g

载脂蛋白E(Apo-E)英文名称：Apo-E ELISA Kit脂肪酰家族成员1抗体包装5g

载脂蛋白B48(apo-B48)英文名称：apo-B48 ELISA Kit芳香烃受体核转录蛋白样2抗体包装100mg

载脂蛋白B100(apo-B100)英文名称：apo-B100 ELISA Kit磷化芳香N-乙酰化转移抗体包装1g

载脂蛋白B100(Apo B100)英文名称：Apo B100 ELISA Kit肌动蛋白结合蛋白1抗体包装500mg

载脂蛋白B(ApoB)英文名称：ApoB ELISA Kit粘附分子IgG样结构域蛋白2抗体包装5g

载脂蛋白A5(apo-A5)英文名称：apo-A5 ELISA Kit肌动蛋白结合蛋白DOC6抗体包装100mg

载脂蛋白A1(apo-A1)英文名称：apo-A1 ELISA KitAFG3样蛋白2/脊髓小脑共济失调蛋白28抗体包装500mg

载脂蛋白A1(Apo A1)英文名称：Apo A1 ELISA Kit激活受体相互作用蛋白1抗体包装1g

孕受体(PROGR)英文名称：PROGR ELISA Kit固类还原家族7成员A2抗体包装5g

孕(PROG)英文名称：PROG ELISA Kit蛋白激AKT1,2,3抗体包装25g

孕激/孕(PROG)英文名称：PROG ELISA Kit帕金森病相关蛋白ATP13A2抗体包装5g

诱导型一氧化合成(iNOS)英文名称：iNOS ELISA Kit肌侧索硬化蛋白2抗体包装100g

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