出血性大肠杆菌PCR检测试剂盒说明书

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

组成及试剂配制:
1、酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
​
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
1,4-Butyrolactone2-噻吩基乙酰 98%乙酸酐 AR,98.5%（易制）

Diallyl phthalate2-苯硫基乙 98%乙酸酐 CP,96

Dially isophthalate五氯苯硫酚 95%乙酸酐 GR（）

Dipentyl phthalate2-氨基二苯硫 98%正丁 AR，98.5%

Dibutyl Adipate苯基乙烯基硫 98%*基氯硅烷 >98.0%(GC)

DBM苯硫基乙酸 98%*基氯硅烷 Wacker quality, ≥99.0% (GC)

Dibutyl phosphate二苯二硫 99%三乙基氯硅烷 98%

DBS2-苯硫基炔 97%过氧化二异苯 99%

Dicyclohexyl phthalateS-苯基硫代乙酸酯 98%二异 94%

Diethyl adipate4-吡啶基吡啶氯盐酸盐 98%乙酸乙酯  for HPLC, >99.0%(GC)

P-2044-苯基-3-硫代氨基脲 98%合联氨 AR,50%溶液

DIOP邻苯二甲酰亚胺 99%合肼，一 98%

DOS苯 色标standard for GC ,>99.5% (GC)六甲基二硅胺烷 CP，97%

DEP苯 98%六次甲基四胺  ≥99.5%(以干基计）

Diethyl sebacate苯 99%邻硝苯 99%

Diethyl succinate苯 分析标准品， ≥99.8% (GC)邻硝苯 分析标准品

三唑酮标准溶液(100μg/ml,溶剂：石油)SHP-1 (C14H6) Rabbit mAbLDHA/LDH  乳酸脱氢酶抗体

甲基托布津(分析标准品)Phospho-IP3 Receptor (Ser1756) AntibodyLCMT1  亮氨酸羧基转移酶1抗体

无硫酸钠(分析标准品,pestizides≤1 ppm)ASK1 AntibodyLck/p56-LCK  淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抗体

甲嘧磺隆(标准品)Phospho-Ubiquitin (Ser65) AntibodyL-Citrulline  L-瓜氨酸抗体

西草净(分析标准品,97%)Phospho-ASK1 (Ser967) AntibodyLCHAD/HADHA  长链烯脂酰辅酶A脱氢酶抗体

五氯(分析标准品,99%)Phospho-ASK1 (Thr845) AntibodyLCEAH/ECHS1  长链烯脂酰辅酶A化酶抗体

五氯标准溶液(10μg/ml,u=2%,基体：苯)Thymidylate Synthase AntibodyLCE2B  晚期包膜蛋白2B抗体

喹禾灵(分析标准品,96%)Phospho-TFEB (Ser211) (E9S8N) Rabbit mAbLCE1A  晚期包膜蛋白1抗体

精喹禾灵(分析标准品，98%)BNIP3 Antibody (Rodent Specific)LCAT  卵磷酯胆固酰基转移酶抗体

二甲戊乐灵(分析标准品,99%)MLKL (D6W1K) Rabbit mAb (Mouse Specific)LCA5L  致盲基因LCA5样蛋白抗体
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检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。