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PCR扩增试剂盒引物设计应遵循的原则

更新时间:2022-08-25点击次数:635
   PCR扩增试剂盒应用前要计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液,向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬时离心10秒。
  引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
  设计引物遵循的原则如下:
  1.引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
  2.引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
  3.引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
  4.避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
  5.引物3'端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
  6.引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子很有好处。
  7.引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
  8.引物量:每条引物的浓度0.1-1umol或10-100pmol,以引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

TEL:021-61210612

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