PCR扩增试剂盒引物设计应遵循的原则

更新时间：2022-08-25

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　　PCR扩增试剂盒应用前要计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。

　　引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

　　设计引物遵循的原则如下：

　　1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

　　2.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

　　3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　4.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

　　5.引物3'端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

　　6.引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子很有好处。

　　7.引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

　　8.引物量：每条引物的浓度0.1-1umol或10-100pmol，以引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。