PCR扩增试剂盒在实验时的几点事项解析

更新时间：2021-07-08

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　　PCR扩增试剂盒提供DNA高保真扩增所需要的基本试剂。DNA扩增时，用户需要自行准备模板和扩增所需要的引物。高温嗜热Pfu DNA聚合酶主要用于对保真度要求非常高的DNA扩增，这些扩增要求扩增的产物中不能出现突变等错误。Taq DNA聚合酶的扩增性能很强，但是用Taq扩增的PCR产物中有难以避免的随机突变。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外，还有3′-5′端外切酶活性，具有校正DNA扩增过程中突变。Pfu DNA的长片段扩增的能力不及Taq DNA聚合酶，用户如果用于长链PCR扩增，可选用Long Taq或者Taq Plus DNA聚合酶。

　　PCR扩增试剂盒的实验事项说明：

　　1.样本上多重PCR平台可以做的样本包括血液、唾液、口腔拭子，在实验中，对于DNA投入量要求不是很高，根据不同项目需求，DNA投入量的范围在100 pg-100 ng之间。

　　2.进行PCR反应前可将所有gDNA的浓度稀释到同一浓度，并转移到PCR八联管中，一方面是便于排枪操作，另一方面是加入相同起始量的gDNA，这样可降低最终文库的浓度差异，便于混合文库。

　　3.大多数情况下引物是一管，操作相当方便；当目标区域是外显子或者是其他连续区域时，我们会把引物分装为二管，分别命名Primer pool T1与Primer pool T2，这时需要第二轮PCR前把产物合并，再进行下一步反应。

　　4.执行多重PCR反应时，特别是样本量多的情况下，可以将T1设为一组，T2设为一组，便于制备反应试剂混合液和排枪操作；并把解冻好的试剂放置在冰盒上，在冰盒上进行加样操作。

　　5.实验中可在PCR管壁上和管盖上同时进行反应编号标记，防止高温或其他原因导致记号消失，避免后续产物混合操作失误，造成样本交叉污染。

　　6.第二轮PCR后，因为B试剂比较粘稠，在清洗纯化的时候不能吸走所有试剂，可以剩余5-10μl，否则会把磁珠一起吸走，造成样品的损失，导致产物回收率下降。

　　实验完成后，正常文库浓度处于5-30 ng/μl，而片段长度一般在280-460 bp之间，且主峰前后无杂峰，就可以进行测序了。