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荧光-PCR法的相关数据处理常识要弄清

更新时间:2022-10-17点击次数:766
   实时荧光-PCR法是在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的技术。它通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。实时荧光定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
  对荧光-PCR法的数据处理我们要了解一个关键的因素“Ct值”。在实时定量PCR的数据图中,x-轴表示PCR循环数,y-轴表示扩增反应的荧光值,也就是扩增产物的量。这个图中有基线、阈值、Ct值这几个概念,从这几个值我们能够最终得到模板中目的基因的含量。
  基线是扩增曲线中的水平部分。在反应初阶段,虽然产物是指数级增长,但是由于总量太少,其荧光处于背景水平,检测不到荧光增加。因此基线信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。然而当累积了足够的扩增产物,足以产生可检测的荧光信号时,这个信号的值就被称为阈值,通常阈值默认为基线信号的标准偏差×10。在阈值的前后,PCR的反应仍然是指数级增长的,因此此时的PCR结果可靠,可以准确地反映体系中模板的初始量。Ct值是信号强度达到阈值时所需要的循环数,也就是扩增曲线与阈值的交叉点。
  为什么知道了Ct值就能够得到初的目的基因含量呢?
  一个基因的单次反应扩增曲线中要计算扩增产物的分子数N,它等于模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方,n代表循环次数。也就是说,如果扩增效率为100%,产物分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是显然,在线性增长期和平台期,扩增效率不可能是100%,因此上述PCR理论方程只在指数期成立。

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