CTSC组织蛋白酶CELISA试剂盒

标本要求：

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

产品属性：

需要而未提供的试剂和器材：

1. 产品仅用于科研标准规格酶标仪

2. 高速离心机

3. 电热恒温培养箱

4. 干净的试管和Eppendof管

5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器

6. 蒸馏水，容量瓶等。

备试剂与收集血样：

1.  收集标本：血清、血浆（EDTA 、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2-8 ℃ 保存48 小时；更长时间须冷冻（ -20   ℃或 -70   ℃ ）保存，避免反复冻融。

2.  标准品液配制：使用前加入0.5ml 蒸馏水 混匀，配成 120 0ng/ml 的溶液 。 设标准 管 8 管，管加标本稀释液 900ul ，第二至第八管加入标本稀释液 500ul 。在管中加入 120 0ng/ml 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul ，移至第二管 。如此反复作对倍稀释，从第七 管 中吸出 500ul 弃去。第八 管 为空白对照。

3.  10× 标本稀释液用蒸馏水作 1: 1 0 倍稀释（ 示例： 1ml浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。

4.  洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例：1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）

检测程序：

1.  加样：每孔各加入标准品或待测样品 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 120 分钟。

2.  洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。

3.  每孔中加入抗体工作液10 0ul 。将反应板充分混匀后置 37 ℃ 6 0 分钟。

4.  洗板：同前。

5.  每孔加酶标抗体工作液100ul 。将反应板置 37 ℃ 3 0 分钟。

样本实验前准备：

ELISA试剂盒液体样本：包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

（1）血清

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（2）血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（3）尿液：

用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

（4）细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

（5）培养细胞

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（6）组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

操作步骤：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒 慈溪麦冬皂苷A二乙二二乙 for HPLC, ≥99%亚麻 ~70% (GC) ，天然

血管内皮生长因子(VEGF)试剂盒 雌酚重氮乙乙酯 91%,≤10% dichloromethane钛四丁酯 ≥99.0% (GC)

血管内皮粘附分子1(VCAM-1/CD106)试剂盒 次大风子素4－羟－环己烷乙酯 98%钛异酯 98%

血管内皮粘附分子1(VCAM-1/CD106)试剂盒 次3-酰-2-乙酯 97%钛四乙酯 33-35% TiO2

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)试剂盒 次野鸢尾黄素扁豆 ≥98.0%硅藻土 CP

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)试剂盒 甘草查尔扁豆 分析标准品3-巯 98%

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体4(TRAIL-R4)试剂盒芒柄花苷2-乙-1,3-己二 分析标准品3-巯 99%，用于生化分析

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体4(TRAIL-R4)试剂盒囊1,2-环氧十二烷 95%3-巯酯  98%

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体3(TRAIL-R3)试剂盒桐乙苯 99.8%，无水级2，4-二苯 99%

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体3(TRAIL-R3)试剂盒五加苷E铬蓝 Indicator2，3-二  98%

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)试剂盒五加皂苷B反式-4-氧肉桂异辛酯 98%三异 90%

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)试剂盒楤木皂苷A麦角考宁 95%苯 Standard for GC，≥99.9% (GC)

肿瘤坏死因子β(TNF-β)试剂盒粗壮女贞苷Nβ-硫丹 分析标准品苯  AR, ≥99.5%

肿瘤坏死因子β(TNF-β)试剂盒醋棉酚EPA 酚类混合物 phenl Mix 80 9个品种2000ng/μl异溶液苯  CP, ≥99.0%

肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒 醋辛酯L-乙硫氨 99%苯  ACS, ≥99.0%

肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒 催吐萝芙木定2-乙炔苯 98%中苯标样 分析标准品
CTSC组织蛋白酶CELISA试剂盒产品背景：

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨suan(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨suan(PS)由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。

AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS 高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。

检测原理：

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨suan(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ能与PS 高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨suan与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了PE的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-PE。

Annexin V-PE 通常与细胞膜非渗透性核酸荧光染料联合使用以检测凋亡细胞。常用的染料是7-AAD。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，核酸染料7-AAD 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，7-AAD 能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。

7-AAD/Annexin V-PE试剂盒将AnnexinⅤ与7-AAD匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与Annexin V-PE和7-AAD 结合显色，而7-AAD 则被排除在活细胞(PE阴性)和早期凋亡细胞(PE阳性)之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被PE和7-AAD 结合染色呈现双阳性。

储存条件：染色液2-8℃避光保存；结合液2-8℃保存；长期不用-20℃保存。

Annexin V-PE染色液避免反复冻融，冻融2次以上可能会失效。长期保存分装后-20℃保存。

有效期：一年。