太米阿米病毒PCR检测试剂盒说明书

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

组成及试剂配制:
1、酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
​
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
Linalool反式 standard for GC正己烷 AR，97%

L-Menthol溴酚红 AR,80%甲基环戊烷 Standard for GC

Loliolid考马斯亮蓝R250 AR甲基环戊烷 94%

Menthone溴甲酚绿钠 AR甲基环戊烷 98%

Mudanpioside C溴甲酚绿钠 98%,高纯级甲基环戊烷 分析标准品，≥99.5% (GC)

Mullilam diol溴甲酚绿钠 ACS reagent, 90 %2-甲基戊烷 82%

rcantharidin溴甲酚绿钠 Indicator碳酸钴(II) CP,Co 43.0 - 47.0 %

Oleuropeic acid 8-O-glucoside盐酸副品红(0.2%盐酸副玫瑰 0.2% 1mol/L,0.2%盐酸副玫瑰苯胺溶液金属锰片  99.9% metals basis,不规则片状

Oleuropeic acid甲酸丁酯 Standard for GC四氧化三锰 SP

Oxypaeoniflorin溴甲酚紫钠盐 AR四氧化三锰 Mn ≥71.0%,  BET surface Area 5～7 m2/g  

Paeoniflorigene溴百里香酚兰钠 AR硫酸镍，七  ACS

Paeoniflorin溴百里酚蓝钠盐 ACS4-羟基吡啶 97%

Paeonilactone A2-丁酮 Standard for GC, ≥99.9% (GC)硫代苹果酸 98%

Paeonilactone B戊酸丁酯  Standard for GC, ≥99.5% (GC)酸钠 AR,99.0%

Paeonilactone C正丁 Standard for GC乙镁 98%

p-Menth-1-ene-3,6-diol溴酚蓝钠 AR碲化镉 99.9999%，6N

2,2,3,3,3-五氟-1-VCP (7F3) Rabbit mAbPGAM1/PGAM2  磷酸变位酶1抗体

1,1,2-三氯三氟乙烷（CFC-113）Histone H3 Antibody (ChIP Formulated)PFKL/Fructose 6 Phosphate Kinase  6磷酸果糖激酶抗体

苯胺（标准品）USP4 AntibodyPFKFB2  果糖-2,6-二磷酸酶心肌酶抗体

烯标准溶液（标准品）Skp2 (D3G5) XP® Rabbit mAbPFKFB1  果糖-2,6-二磷酸酶1抗体

磷酸氢二铵Skp2 (D3G5) XP® Rabbit mAbPFK2/PFKFB3  6磷酸果糖激酶2抗体

Amberlite?IRA402 强碱型阴离子交换树脂(氯型)Stat4 (C46B10) Rabbit mAbPescadillo  雌激素受体共调节因子抗体

Amberlite XAD-1180N 非离子型多孔树脂(粒径0.350 - 0.600 mm)CD161/KLRB1 (HP-3G10) Mouse mAb (violetFluor™ 450 Conjugate)Persephin  PSP抗体

嘧菌酯（标准品）Ron (C81H9) Rabbit mAbPERP/p53 apoptosis effector related to PMP22  p53凋亡相关作用蛋白PMP22抗体

双甲脒标准溶液（10μg/ml,u=4%）BCL6 (D4I2V) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)Peroxiredoxin 2/PRXII  硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ/巯基抗氧化蛋白抗体

双甲脒标准溶液（100μg/ml,u=2%）CK1 AntibodyPerlecan/Heparan Sulfate Proteoglycan 2  硫酸乙酰肝素蛋白多糖2
太米阿米病毒PCR检测试剂盒说明书2,3-Dimethyl-4-nitroanisole,95%通用试剂　10G

2,6-Difluoroanisole,98%通用试剂　1G

2,5-Difluoroanisole,98%通用试剂　5G

2,4-Difluoroanisole,99%通用试剂　5G

2-Chloro-5-nitroanisole,98%通用试剂　5G

2-Chloro-5-fluoroanisole,97%通用试剂　5G

2-Chloro-4-fluoroanisole,97%通用试剂　5G

4-Bromo-3-nitroanisole,97%通用试剂　5G

2-Bromo-5-nitroanisole,98%通用试剂　1G

4-Bromo-2,5-difluoroanisole,99%通用试剂　5G

4-Bromo-2-methylanisole,98%通用试剂　5G

2-Bromoethyl ether,90%通用试剂　5ML

2-Bromo-4-fluoroanisole,96%通用试剂　5G

2-Bromo-5-fluoroanisole,99%通用试剂　5G

2,3-Dimethylanisole,97%通用试剂　5G
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。