布氏锥尾线虫PCR检测试剂盒说明书

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

组成及试剂配制:
1、酶标板：一块（96孔）
2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液：1×20ml。
4、 检测稀释液A：1×10ml。
5、 检测稀释液B：1×10ml。
​
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行设立一个的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
Cyclo(Tyr-Phe)LB肉汤 BR三氯叔丁 药用级

Cyclo(Tyr-Pro)麦芽浸膏 BR三氯叔丁 98%

Cyclo(Tyr-Val)麦芽浸膏 BR三氯叔丁 分析标准品

Cyclo(Val-Hpro)M汤 BR无柠檬酸 AR, ≥99.5% (T)

D-arabinitol马铃薯葡萄糖琼脂 BR蓖麻油 USP级

Dencichin马铃薯葡萄糖肉汤 BR蓖麻油 CP

Deoxymorellin双糖铁尿素琼脂 BR玉米油 试剂级

Deoxyjirimycin hydrochloride改良V-P培养基 BR玉米油 药用级

DesoxygambogeninV-P半固体琼脂 BR尼泊金乙酯 CP,99.0%  

D-Glucosamine hydrochloride我妻氏培养基基础 BR羊毛脂 药用级

D-(+)-GlucoseDL-泛  99%羊毛脂 CP

Diallyl disulfide氯化铋 ARDL-苹果酸 AR，99.5%

Dihydrorotene溴化亚铜 CP,99.0%山梨酸 >99.0%(T)

Dimethylamipyridine柠檬酸铜 AR,99.5%山梨酸 CP,98%

Dipalmitin乙酸铜 一合物  AR,99.0%山梨酸 分析标准品

Doxycycline乙酸铜 一合物  CP,98.0%山梨酸 药用级

氢氧化钠标准溶液(0.1000mol/L(0.1N))SimpleChIP® Human c-Fos Upstream Primersphospho-ATG4C(Ser166)  磷酸化自噬相关蛋白4C抗体

草酸钠容量分析用溶液标准物质Phospho-PLCγ1 (Tyr783) (D6M9S) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)phospho-ATG4A(Ser100)  磷酸化自噬相关蛋白4A抗体

硝酸银标准溶液(0.1017mol/L)Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG3 (Tyr18)  磷酸化自噬相关蛋白3抗体

硝酸银标准溶液(0.1000mol/L(0.1N))Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG16A(Ser287)  磷酸化自噬相关蛋白16A抗体

硝酸银标准溶液(0.01000mol/L(0.01N))Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibodyphospho-ATG16A(Ser213)  磷酸化自噬相关蛋白16A抗体

百里香酚蓝(IND)Human Insulin-like Growth Factor II (hIGF-II)Phospho-ATG1(Ser556)  磷酸化自噬相关蛋白1抗体

百里香酚蓝(ACS reagent,95 %)TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAbphospho-ATF4/CREB-2(Ser245)  磷酸化活化转录因子4抗体

喹哪啶红TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAbphospho-ATF2(Thr69/71)  磷酸化活化复制因子2抗体

酚酞(98%)Acetyl-p53 (Lys379) Antibodyphospho-ATF2(Ser94)  磷酸化活化复制因子2抗体

四溴酚蓝Acetyl-Histone H2B (Lys20) Antibodyphospho-ATF2(Ser472)  磷酸化活化复制因子2抗体
布氏锥尾线虫PCR检测试剂盒说明书4-Piperidone hydrate hydrochloride通用试剂　10G

D-Allylglycine hydrochloride通用试剂　250MG

N-Amipiperidine hydrochloride通用试剂　5G

Chlorodipyrrolidicarbenium hexafluor...通用试剂　5G

DMTMM通用试剂　1G

(R)-3-Hydroxypyrrolidine hydrochloride通用试剂　1G

3-Hydroxyazetidine Hydrochloride,≥98.0%通用试剂　250MG

2-(Chloromethyl)-4-methoxy-3,5-dimethy...通用试剂　5G

S-Methylisothiourea Sulfate,≥98.0%通用试剂　100G

DL-Homocysteine thiolactone hydrochlor...通用试剂　25G

4-Pyridineacetic Acid Hydrochloride,≥...通用试剂　1G

1-Amidipyrazole Hydrochloride通用试剂　5G

Isonicotiyl chloride hydrochloride,...通用试剂　5G

Mebhydrolin napadisylate通用试剂　1G

Memantine Hydrochloride通用试剂　250MG
检测步骤：
一、 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
总量 15 µL N×15µL
（1） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。