一般荧光定量PCR试剂盒的标本预处理简介

更新时间：2021-10-15

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　　荧光定量PCR试剂盒采用标本RNA逆转录(RT)-实时荧光扩增(PCR)两步合并单管反应,操作简便；采用荧光染料的实时定量PCR,灵敏度高于荧光探针PCR一个数量级,每个反应达10个拷贝/次；自主产权不形成二聚体的引物设计使PCR反应背景干净,特别对于极低浓度病毒样本定量准确,对弱阳性判读可靠；选取人肠道病毒(EV)最保守的5’端非编码区特异序列5’UTR(423-440)反意义链作为逆转录引物和PCR下游引物,5’UTR(191-208)序列为PCR上游引物,扩增产生250bp片段,特异性达100%；聚合酶热启动、中间同序引物对等优化措施使系统重复性好。

　　实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物荧光信号达到对数期的循环数Ct值与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数（Ct值）。

　　荧光定量PCR试剂盒的标本预处理说明：

　　选直肠试子或粪便浸出液(或血清、脑脊液、细胞培养物)0.1ml,粪便浸出液须自然沉淀10分钟,取上清0.1ml(或0.1g固体标本)加裂解液1ml(0.5ml的4M异硫氰酸胍+0.5ml水饱和酚)变性裂解，强烈漩涡振荡，再加100μl氯仿振荡，最高速离心10分钟，取上清加3×结合缓冲液(6M碘化纳NaI)移至商业硅胶纯化柱，用洗涤缓冲液(含70%EtOH的2M NaI液)洗柱两次，加50μl DEPC处理的dH2O洗脱、离心收集纯化的RNA。或裂解上清加等量异丙醇和1/10体积的2M醋酸钠(PH4.0)置-20℃2小时再离心沉淀，75%冷乙醇洗涤一次，加50μl DEPC处理的dH2O溶解。