荧光-PCR法试验的成功离不开优良的试剂

更新时间：2021-05-12

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　　荧光-PCR法是利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。将已知浓度的标准品梯度稀释进行PCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

　　荧光-PCR法实验成功的因素离不开优良试剂的选择：

　　1.标准曲线的质量直接影响定量的准确性。建议使用标准品专用稀释Buffer稀释标准品。

　　2.根据采用的荧光检测方法进行试剂选择。选择探针法专用试剂。

　　3.RT-PCR要根据实验目的进行试剂选择。mRNA表达量分析选择两步RT-PCR试剂，病毒病原菌检测选择一步RT-PCR试剂。

　　4.PCR反应通常样品数量较多，操作步骤过多易产生错误。选择PCR反应用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等试剂已经预混在一起的试剂，操作更加简单方便。同时，使用的试剂最好不需要进行Mg2＋浓度的优化等实验。

　　5.PCR反应对反应特异性要求高。最好选择应用DNA聚合酶的试剂。但有一点需要强调，DNA聚合酶有两种类型，即化学修饰型和抗体结合型。使用这两种DNA聚合酶的PCR反应条件不同，使用化学修饰型DNA聚合酶，需要在PCR条件的起初步骤设置10-15分钟的热变性程序，以恢复DNA聚合酶的活性；而抗体结合型DNA聚合酶，不需长时间的热变性步骤，通常的PCR条件即可恢复DNA聚合酶的活性，适合快速PCR反应。

　　6.所选试剂要与使用的RT-PCR检测系统相匹配。最好选择对各种机型装置都显示良好反应性能的试剂。