狼源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒​检测方法步骤

狼源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒检测方法步骤：

(1)将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；

(2)待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中步骤(1)为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。

其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，优选地为RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为PCR克隆载体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例较佳地为1：1。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为1:1，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高HER2基因扩增检测的可靠性。

步骤(2)为：待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为HER2基因的扩增区域，所述荧光定量PCR扩增为本领域常规荧光定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多通道荧光定量PCR扩增，更佳地为双通道荧光定量PCR扩增。

NRK-52E，大鼠肾细胞

H9c2大鼠心肌细胞（ATCC来源）

C2C12, 小鼠肌原细胞

NIH/3T3, 小鼠成纤维细胞系

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星状细胞系

CHO, 中国仓鼠卵巢细胞系

COS-7L, 非洲绿猴肾成纤维细胞

SF9, 昆虫卵巢细胞

BRL 3A, 大鼠肝正常细胞

HK-2, 人肾皮质近曲小管上皮细胞

HET-1A, 人食管上皮细胞

RGC-5, 小鼠视网膜神经节细胞

GC-1, 鼠精原细胞

293A，人胚肾上皮细胞系（腺病毒包装级别）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干细胞

293T, SV40转化的人胚肾上皮细胞系

EPC, 大鼠血管内皮祖细胞

HBE, 正常人支气管上皮细胞系

HL-02 [L-02,HL-7702], 正常人肝上皮细胞

HUVEC-12, 人脐静脉血管内皮细胞系

HUM, 正常人主动脉平滑肌细胞

HAVSMC, 人主动脉平滑肌细胞

LX-2, 人肝星形细胞株

3T3-L1, 小鼠前脂肪细胞