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引物退火温度会影响到荧光-PCR法?

更新时间:2021-11-10点击次数:803
   定量荧光-PCR法是在PCR定性技术基础上发展起来的定量技术。实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实现了PCR从定性到定量的飞跃。
  简单的说,就是在PCR体系中加入荧光,以便对反应体系和反应进程进行监测、记录、分析。而荧光PCR仪是在普通PCR的基础上加上个荧光探头和相应的数据处理软件。
  说道引物的一个重要参数是熔解温度(Tm),这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55-70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
  设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法。从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有软件会自动计算引物的Tm值,在设置退火温度时可如下进行:
  以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得理想结果,两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比低的Tm低5℃。或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

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