荧光-PCR法反应体系中的引物和dNTP浓度

　　荧光-PCR法反应体系中的引物和dNTP浓度：

　　1.定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。因脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。

　　2.引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

　　3.引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：

　　X mol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)。

　　X：引物摩尔浓度,A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。

　　4.不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。

　　5.dNTP溶液呈酸性，普通厂家的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度计定量。配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。多次冻融会使dNTP降解。

　　6.决定低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，理论上在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

　　7.在PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L，当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

　　8.dNTP含有磷酸根，能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2+的浓度。