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荧光-PCR法反应体系中的引物和dNTP浓度

发布时间: 2021-10-13  点击次数: 13次
   实时荧光-PCR法不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于应用了荧光探针,可通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高准确性,克服了常规PCR的许多缺点。
  荧光-PCR法反应体系中的引物和dNTP浓度:
  1.定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。因脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少,因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化,以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100%。这是个循环过程,在每个碱基加入时使用重复化学反应,使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物,尤其是大于50个碱基,截断序列的比例很大,可能需要纯化。
  2.引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物,使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好,因为水的pH经常偏酸,会引起寡核苷的水解。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。
  3.引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
  X mol/L=OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)。
  X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。
  4.不要使用寡聚核苷酸作为标准,在EB染色的胶上估算引物浓度,因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。
  5.dNTP溶液呈酸性,普通厂家的dNTP溶液一般均未调pH,应用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将dNTP贮存液pH调至7.0,以保证反应的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度计定量。配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。多次冻融会使dNTP降解。
  6.决定低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成,理论上在100μl反应体系中,4×dNTPs浓度若用20μmol/L,基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
  7.在PCR反应中,dNTP应为50-200umol/L,当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
  8.dNTP含有磷酸根,能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此,在高浓度DNA及dNTP条件时,必须相应调整Mg2+的浓度。

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