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荧光-PCR法的主要理论依据说明

发布时间: 2021-04-08  点击次数: 262次
   荧光-PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程。PCR扩增时加入一对引物和一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,淬灭基团抑制报告基团的荧光发射。刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上,PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,报告基团与淬灭基团发生分离,抑制作用被解除,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。随着PCR反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件对产物进行分析进而得到一条荧光扩增曲线。荧光扩增曲线分荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期三个阶段。指数期的PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,因此我们选择在这个阶段进行定量分析,计算出待测样品初始模版的量。
  荧光-PCR法的理论依据是什么?
  特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果:Y=X×2n;其中:Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数,n为扩增次数;理论上PCR扩增效率为100,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y=X(1+E)n,其中:E代表扩增效率,E=参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1-105拷贝、循环次数n≤30时,E相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y呈非固定的指数形式增加,后进入平台期。

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