荧光-PCR法的主要理论依据说明

 　　荧光-PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程。PCR扩增时加入一对引物和一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，淬灭基团抑制报告基团的荧光发射。刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上，PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件对产物进行分析进而得到一条荧光扩增曲线。荧光扩增曲线分荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期三个阶段。指数期的PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此我们选择在这个阶段进行定量分析，计算出待测样品初始模版的量。