NK自然杀伤细胞ELISA试剂盒操作步骤

【中文名称】：NK自然杀伤细胞ELISA试剂盒

【英文名称】：NK ELISA Kit

【产品规格】：96T/48T。

【保存条件】：2-8℃低温保存

【保质期】：6个月，所有试剂盒均提供批次。

一、实验前准备

仪器与耗材：提前校准移液器（误差≤5%），准备酶标仪（检测波长450nm）、37℃恒温箱、高精度加样器及对应枪头、蒸馏水/去离子水。

试剂平衡：试剂盒从4℃冷藏环境取出后，需室温平衡20~30分钟；剩余未使用的板条应立即用自封袋密封，放回4℃保存。

样品预处理：

血清/血浆：血液样本1000×g离心10分钟分离血清；EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝血浆需1000×g离心30分钟去除颗粒。

细胞上清：1000×g离心10分钟去除细胞碎片和聚合物。

组织匀浆：组织加入适量生理盐水捣碎后，1000×g离心10分钟取上清，分装后-20℃/-80℃保存，避免反复冻融。

二、核心操作步骤

加样：

设置空白孔、标准品孔和样本孔，除空白孔外，标准品孔和样本孔每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜密封反应孔。

加样时避免产生气泡，枪头不可触及孔壁，不同试剂/样本需更换枪头防止交叉污染。

孵育：37℃恒温孵育60分钟，孵育期间酶标板需平放，避免液体溢出和温度波动。

洗涤：甩去孔内液体，每孔注满洗涤液，浸泡30~60秒后甩干，重复洗涤3次，每次甩干后需在吸水纸上拍干，避免残留液体。

显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟，此时孔内溶液会由无色变为不同程度的蓝色。

终止：每孔加入终止液50μL，终止液添加顺序需与底物添加顺序一致，溶液会由蓝色变为黄色；若出现绿色，需充分混匀后再读数。

读数：加终止液后15分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值。

三、结果计算

以标准品浓度为横坐标、对应OD值为纵坐标绘制标准曲线，推荐使用CurveExpert等专业软件选择四参数方程拟合，将样品OD值代入方程即可计算出对应浓度。样品需设置复孔/三孔，复孔变异系数应小于20%。

四、注意事项

标准品需分装后-20℃保存，严禁反复冻融；洗涤液需现用现配。

若所有孔均无明显颜色，需检查试剂是否混淆、酶标物是否失活、是否遗漏操作步骤。

若背景颜色过深，通常与洗涤不充分、试剂污染、显色时间过长有关。