细胞凋亡阳性对照试剂盒操作程序

细胞凋亡阳性对照试剂盒操作程序：

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。

10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

13.滴加化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。

14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

15.必要时苏木素复染，充分水洗。

16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。

本试剂盒含有两种不同的细胞凋亡诱导试剂，试剂A和试剂B。细胞凋亡诱导试剂A(Apopida)和试剂B(Apobid)分别可以诱导Hela、HEK293、CHO、COS等常见细胞的细胞凋亡。

由于细胞凋亡的诱导具有细胞特异性，细胞凋亡的机制也具有一定的细胞特异性，尽管细胞凋亡诱导试剂A和试剂B可以诱导常见的一些细胞的细胞凋亡，但是我们无法保证这两种试剂可以诱导任何一种细胞发生凋亡。细胞凋亡诱导试剂A和试剂B相互补充，可以诱导更多种类的细胞产生凋亡。本试剂盒至少可用于检测200个样品。

高密度聚乙烯Polyethylene, High Density9002-88-4

L-焦性麸质酸;L-焦性胶氨酸;L-2-吡咯烷酮-5-羧酸L-PyroglutaMic acid;L-GlutiMinic acid;GlutiMic acid;GlutaMic acid lactaM;α- AMinoglutaric acid lactaM;L-5-Oxo-2-pyrrolidine carboxylic acid;(S)-(-)-2-Pyrrolidone-5-carboxylic acid98-79-3

L-异赤丝藻氨基酸L-Threonine;L-β-Hydroxy-2-aMinobutyric acid;(2S,3R)-2-AMino-3-hydroxybutyric acid;(2S,3R)-(-)-Threonine72-19-5

L-甲状腺素钠;L-甲状腺胺钠;3,5,3′,5′-四碘甲状腺-L-原氨L-Thyroxine sodiuMsalt;3,3′,5,5′-Tetraiodo-L-thyronine sodiuM salt pentahydrate;SodiuM levothyroxine;Levothyroxine sodiuM;Eltroxin;Thyroxevan;25416-65-3

L-甲状腺素;3,5,3′,5′-四碘-L-甲状腺原氨酸;3-[4-(4-羟基-3,5-二碘苯氧基)-3,5-二碘苯基]-LL-Thyroxine;3-[4-(4-Hydroxy-3,5-diiodophenoxy)-3,5-diiodophenyl]-L-alanine;β-[(3,5-Diiodo-4-hydroxyphenoxy)-3,5-diiodophenyl]-L-alanine51-49-0

;L-β-对羟苯基-α-氨基丙酸;L-干酪氨基酸L-Tyrosine;(S)-2-AMino-3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid;3-(4-Hydroxyphenyl)-L-alanine;L-α-AMino-β-p-hydroxyphenylpropionic acid;L-α-AMino- p-hydroxyhydrocinnaMic acid60-18-4

淋巴细胞分离液LyMphocyte separation Media;

麦康凯琼脂;麦康克琼脂Mac Conkey agar;

氟化镁MagnesiuM fluoride;Afluon;Sellaite7783-40-6

MagnesiuM Hydroxide (AS);Marinco H1309-42-8

MagnesiuM Stearate (AS);DoloMol577-04-0

MagnesiuM trisilicate;MagnesiuM silicate;MagnesiuM Mesotrisillicate14987-04-3

苹果酸Malic Acid;4455-77-0

丙二酰胺MalonaMide;PropanediaMide;108-13-4

丙二腈 99％Malonic acid141-82-2

丙二腈;氰化亚甲基;二氰甲烷;氰基乙腈;缩苹果腈Malonitrile;Methylene cyanide;DicyanoMethane;CyanoacetonitrileMandelic Acid (AS);α-Hydroxyphenylacetic acid;Phenylhydroxyacetic acid;Phenylglycolic acid;α-Hydroxybenzeneacetic acid;dl-Mandelic acid90-64-2

Manganese Chloride (AS)7773/1/5