RT-PCR试剂盒的PCR反应及注意事项说明

　　RT-PCR试剂盒是为两步法RT-PCR一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly(A)+RNA合成一链cDNA。与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。合理配备与cDNA一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。

　　RT-PCR试剂盒试验时进行的PCR反应：

　　1.吸取10%的一链反应液（2μl）进行PCR反应；即使加入更多量的一链反应液也不能增加其扩增的产物量，反而可能会抑制正常的PCR反应；

　　2.94℃加热变性2min；

　　3.设置15-40个PCR循环。退火与延伸条件依引物和模板而定。

　　相关注意事项：

　　1.用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

　　2.RNA样品要避免基因组DNA污染。

　　3.避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。

　　4.试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。

　　5.cDNA产物应置于-20℃保存。